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Making a drug or a food flavouring often means oxidising alcohols, a step chemists usually perform with harsh oxidants at high temperatures, which leaves toxic waste behind. Living organisms offer a gentler route. Fungi produce galactose oxidases, enzymes that carry out the same reactions on alcohols and simple sugars under mild conditions, using oxygen. Until now, the best-characterised versions came from fungi. A team at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier of NOVA University Lisbon (ITQB NOVA), in Portugal, has now described the first galactose oxidase found in bacteria, which it calls PsGalOx.
Für die Herstellung eines Arzneimittels oder eines Lebensmittelaromas muss oft Alkohol oxidiert werden, ein Schritt, den Chemiker meist mit aggressiven Oxidationsmitteln bei hohen Temperaturen durchführen, wobei giftiger Abfall entsteht. Lebende Organismen bieten einen schonenderen Weg. Pilze produzieren Galactose-Oxidasen, Enzyme, die dieselben Reaktionen an Alkoholen und einfachen Zuckern unter milden Bedingungen mit Sauerstoff ausführen. Bislang stammten die am besten charakterisierten Varianten aus Pilzen. Ein Team am Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier der NOVA-Universität Lissabon (ITQB NOVA) in Portugal hat nun die erste Galactose-Oxidase aus Bakterien beschrieben, die es PsGalOx nennt.
The enzyme was hard to work with for years. "For several years, the enzyme proved exceptionally difficult to produce in a soluble form and therefore to characterize," says Lígia Martins, who leads the Microbial & Enzyme Technology laboratory at ITQB NOVA. What changed was AlphaFold, an AI system whose structure predictions helped the team see the enzyme's unusual architecture and identify changes that could improve its production. The bacterial version carries two nearly identical sugar-binding modules next to its catalytic module, a feature the best-known fungal versions do not have. Tomás Frazão, a doctoral student and one of the paper's first authors, says the two copies, which share about 80% sequence identity, have distinct jobs: one enhances sugar binding, the other mainly contributes to protein stability. The team thereby challenges the common assumption that such modules are interchangeable.
Das Enzym war jahrelang schwer handhabbar. „Mehrere Jahre lang erwies sich das Enzym als außergewöhnlich schwer in löslicher Form herzustellen und damit auch schwer zu charakterisieren“, sagt Lígia Martins, die das Labor für Mikrobielle und Enzymtechnologie am ITQB NOVA leitet. Entscheidend war AlphaFold, ein KI-System, dessen Strukturvorhersagen dem Team halfen, die ungewöhnliche Architektur des Enzyms zu erkennen und Veränderungen zu identifizieren, die seine Herstellung verbessern könnten. Die bakterielle Variante besitzt neben ihrem katalytischen Modul zwei nahezu identische Zuckerbindungsmodule, ein Merkmal, das den bekanntesten Pilzvarianten fehlt. Tomás Frazão, Doktorand und einer der Erstautoren der Studie, sagt, die beiden Kopien, die etwa 80 % Sequenzidentität aufweisen, hätten unterschiedliche Aufgaben: Das eine verstärkt die Zuckerbindung, das andere trägt vor allem zur Stabilität des Proteins bei. Das Team stellt damit die verbreitete Annahme infrage, solche Module seien austauschbar.
The researchers then applied directed evolution, which recreates natural selection in the lab: they introduced mutations and screened thousands of bacterial colonies for better variants. The similar modules recombined into single hybrid modules, and these variants produced more soluble protein. The team also found that higher activity did not necessarily mean the enzyme had become a better catalyst; much of the improvement came from cells making more of it, and recognising that was key to further progress. The final variant is 40 to 1,800 times more efficient at processing a range of sugars and alcohols.
Die Forscher wandten anschließend die gerichtete Evolution an, die im Labor natürliche Selektion nachbildet: Sie führten Mutationen ein und prüften Tausende bakterielle Kolonien auf bessere Varianten. Die ähnlichen Module rekombinierten zu einzelnen Hybridmodulen, und diese Varianten produzierten mehr lösliches Protein. Das Team stellte außerdem fest, dass eine höhere Aktivität nicht unbedingt bedeutete, dass das Enzym ein besserer Katalysator geworden war. Ein großer Teil der Verbesserung ging darauf zurück, dass die Zellen mehr davon herstellten, und diese Erkenntnis war entscheidend für den weiteren Fortschritt. Die endgültige Variante ist bei der Verarbeitung einer Reihe von Zuckern und Alkoholen 40- bis 1.800-mal effizienter.
For chemists and manufacturers, the gain is a potentially cleaner way to make intermediates that feed food, drug and materials production, since the reaction runs under mild conditions with oxygen. Who benefits, and when, is not yet settled. The team plans to keep engineering PsGalOx to act on "substrates of practical interest", aiming at a versatile intermediate for food, pharmaceutical and materials applications, and it wants to map the evolutionary diversity of bacterial oxidases. No industrial partner and no commercial date have been announced.
Für Chemiker und Hersteller bedeutet der Fortschritt einen möglicherweise saubereren Weg zur Herstellung von Zwischenprodukten, die in die Produktion von Lebensmitteln, Arzneimitteln und Werkstoffen einfließen, da die Reaktion unter milden Bedingungen mit Sauerstoff abläuft. Wer wann davon profitiert, ist noch offen. Das Team plant, PsGalOx weiter zu optimieren, damit es auf „Substrate von praktischem Interesse“ wirkt, und strebt ein vielseitig einsetzbares Zwischenprodukt für Lebensmittel, Pharmazeutika und Werkstoffe an. Außerdem will es die evolutionäre Vielfalt bakterieller Oxidasen kartieren. Ein industrieller Partner und ein kommerzieller Termin wurden nicht bekannt gegeben.
The limits are clear. Every result comes from laboratory work, the 40 to 1,800 range spans many different substrates rather than one product, and the enzyme has not yet been reported in an industrial process. The next test is whether the same gains hold on the sugars and alcohols that manufacturers actually need.
Die Grenzen sind klar. Alle Ergebnisse stammen aus Laborarbeiten, die Spanne von 40 bis 1.800 umfasst viele verschiedene Substrate statt eines einzelnen Produkts, und das Enzym wurde bislang in keinem industriellen Verfahren beschrieben. Der nächste Test besteht darin, ob sich dieselben Gewinne bei den Zuckern und Alkoholen bestätigen, die Hersteller tatsächlich benötigen.