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Making a drug or a food flavouring often means oxidising alcohols, a step chemists usually perform with harsh oxidants at high temperatures, which leaves toxic waste behind. Living organisms offer a gentler route. Fungi produce galactose oxidases, enzymes that carry out the same reactions on alcohols and simple sugars under mild conditions, using oxygen. Until now, the best-characterised versions came from fungi. A team at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier of NOVA University Lisbon (ITQB NOVA), in Portugal, has now described the first galactose oxidase found in bacteria, which it calls PsGalOx.
Produrre un farmaco o un aroma alimentare spesso significa ossidare alcoli, una fase che i chimici realizzano di solito con ossidanti aggressivi ad alte temperature, lasciando dietro di sé rifiuti tossici. Gli organismi viventi offrono una via più delicata. I funghi producono galattosio ossidasi, enzimi che compiono le stesse reazioni su alcoli e zuccheri semplici in condizioni blande, usando l'ossigeno. Fino ad oggi, le versioni meglio caratterizzate provenivano dai funghi. Un team dell'Istituto di tecnologia chimica e biologica António Xavier dell'Università NOVA di Lisbona (ITQB NOVA), in Portogallo, ha ora descritto la prima galattosio ossidasi trovata nei batteri, che chiama PsGalOx.
The enzyme was hard to work with for years. "For several years, the enzyme proved exceptionally difficult to produce in a soluble form and therefore to characterize," says Lígia Martins, who leads the Microbial & Enzyme Technology laboratory at ITQB NOVA. What changed was AlphaFold, an AI system whose structure predictions helped the team see the enzyme's unusual architecture and identify changes that could improve its production. The bacterial version carries two nearly identical sugar-binding modules next to its catalytic module, a feature the best-known fungal versions do not have. Tomás Frazão, a doctoral student and one of the paper's first authors, says the two copies, which share about 80% sequence identity, have distinct jobs: one enhances sugar binding, the other mainly contributes to protein stability. The team thereby challenges the common assumption that such modules are interchangeable.
L'enzima è stato difficile da gestire per anni. «Per diversi anni, l'enzima si è rivelato eccezionalmente difficile da produrre in forma solubile e quindi da caratterizzare», afferma Lígia Martins, che dirige il laboratorio Microbial & Enzyme Technology dell'ITQB NOVA. A cambiare le cose è stato AlphaFold, un sistema di intelligenza artificiale le cui previsioni di struttura hanno aiutato il team a visualizzare l'architettura insolita dell'enzima e a individuare modifiche capaci di migliorarne la produzione. La versione batterica possiede due moduli di legame allo zucchero quasi identici accanto al modulo catalitico, una caratteristica che le versioni fungine più note non hanno. Tomás Frazão, dottorando e uno dei primi autori dello studio, spiega che le due copie, che condividono circa 80% di identità di sequenza, hanno compiti distinti: una potenzia il legame con lo zucchero, l'altra contribuisce soprattutto alla stabilità della proteina. Il team sfida così il presupposto comune secondo cui tali moduli sarebbero intercambiabili.
The researchers then applied directed evolution, which recreates natural selection in the lab: they introduced mutations and screened thousands of bacterial colonies for better variants. The similar modules recombined into single hybrid modules, and these variants produced more soluble protein. The team also found that higher activity did not necessarily mean the enzyme had become a better catalyst; much of the improvement came from cells making more of it, and recognising that was key to further progress. The final variant is 40 to 1,800 times more efficient at processing a range of sugars and alcohols.
I ricercatori hanno quindi applicato l'evoluzione diretta, che ricrea in laboratorio la selezione naturale: hanno introdotto mutazioni e vagliato migliaia di colonie batteriche alla ricerca di varianti migliori. I moduli simili si sono ricombinati in singoli moduli ibridi, e queste varianti hanno prodotto più proteina solubile. Il team ha inoltre constatato che una maggiore attività non significava necessariamente che l'enzima fosse diventato un catalizzatore migliore; gran parte del miglioramento derivava dal fatto che le cellule ne producevano di più, e riconoscerlo è stato decisivo per i progressi successivi. La variante finale è da 40 a 1.800 volte più efficiente nel trattare una serie di zuccheri e alcoli.
For chemists and manufacturers, the gain is a potentially cleaner way to make intermediates that feed food, drug and materials production, since the reaction runs under mild conditions with oxygen. Who benefits, and when, is not yet settled. The team plans to keep engineering PsGalOx to act on "substrates of practical interest", aiming at a versatile intermediate for food, pharmaceutical and materials applications, and it wants to map the evolutionary diversity of bacterial oxidases. No industrial partner and no commercial date have been announced.
Per chimici e produttori, il vantaggio è una via potenzialmente più pulita per realizzare intermedi destinati alla produzione di alimenti, farmaci e materiali, dato che la reazione avviene in condizioni blande con l'ossigeno. Chi ne trarrà beneficio, e quando, non è ancora stabilito. Il team intende proseguire nell'ingegnerizzazione di PsGalOx per agire su «substrati di interesse pratico», puntando a un intermedio versatile per applicazioni alimentari, farmaceutiche e nei materiali, e vuole mappare la diversità evolutiva delle ossidasi batteriche. Non sono stati annunciati né partner industriali né una data commerciale.
The limits are clear. Every result comes from laboratory work, the 40 to 1,800 range spans many different substrates rather than one product, and the enzyme has not yet been reported in an industrial process. The next test is whether the same gains hold on the sugars and alcohols that manufacturers actually need.
I limiti sono chiari. Ogni risultato proviene da lavori di laboratorio, l'intervallo da 40 a 1.800 volte abbraccia molti substrati diversi anziché un solo prodotto, e l'enzima non è ancora stato segnalato in un processo industriale. Il prossimo banco di prova sarà verificare se gli stessi guadagni si confermano sugli zuccheri e sugli alcoli di cui hanno realmente bisogno i produttori.