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Scientists have long used CRISPR, the gene-editing tool, to make precise changes to DNA. Its cousin Cas13a works on something else: RNA, the genetic material carried by viruses such as HIV. At Rice University, a team has now made Cas13a 100 times more sensitive, in lab tests, at spotting that RNA. The work was led by associate professor Yang Gao and graduate student Seye Oladeji, who is the first author of the study published in Cell Chemical Biology.
Gli scienziati usano da tempo CRISPR, lo strumento di editing genetico, per apportare modifiche precise al DNA. Il suo cugino Cas13a agisce su un altro bersaglio: l'RNA, il materiale genetico trasportato da virus come l'HIV. Alla Rice University, un team ha ora reso Cas13a 100 volte più sensibile, nei test di laboratorio, nell'individuare quell'RNA. Il lavoro è stato guidato dal professor associato Yang Gao e dallo studente di dottorato Seye Oladeji, primo autore dello studio pubblicato su Cell Chemical Biology.
The problem they set out to solve was a familiar one in diagnostics. A detection test uses an enzyme that binds to a target strand of RNA and then produces a signal, such as a colour change, that a person or a machine can read. Most such assays need harsh conditions to produce that signal. The team's starting version of Cas13a could handle those conditions, but it missed very small amounts of the target. Oladeji's stated ideal is a test that detects as little as one strand of RNA per microliter, around a drop of blood. The starting enzyme was far from that.
Il problema che i ricercatori volevano risolvere è un classico della diagnostica. Un test di rilevamento usa un enzima che si lega a un filamento bersaglio di RNA e poi produce un segnale, come un cambio di colore, che una persona o una macchina può leggere. La maggior parte di questi test richiede condizioni difficili per generare quel segnale. La versione di partenza di Cas13a reggeva quelle condizioni, ma non rilevava quantità molto piccole del bersaglio. L'obiettivo ideale indicato da Oladeji è un test capace di individuare fino a un solo filamento di RNA per microlitro, più o meno una goccia di sangue. L'enzima di partenza era ben lontano da questo risultato.
The fix began with the protein's shape. Cas13a moves a great deal when it binds its target, which makes its structure hard to capture in fine detail. Oladeji designed a way to hold the enzyme and its RNA target still long enough to resolve it. With the structure in hand, the team picked two candidate regions and tested them in the lab. Altering both made the enzyme too sensitive, so it signalled even without the target. Altering just one raised sensitivity 100-fold, with no loss of stability. The engineered enzyme was then tested against a synthetic, noninfectious HIV sample, where it worked with the same 100-fold improvement.
La soluzione è partita dalla forma della proteina. Cas13a si muove molto quando si lega al suo bersaglio, il che rende difficile catturarne la struttura nei dettagli. Oladeji ha messo a punto un metodo per tenere fermi l'enzima e il suo bersaglio di RNA abbastanza a lungo da risolverne la struttura. Con la struttura in mano, il team ha scelto due regioni candidate e le ha testate in laboratorio. Modificarle entrambe ha reso l'enzima troppo sensibile, tanto che emetteva un segnale anche senza il bersaglio. Modificarne soltanto una ha aumentato la sensibilità di 100 volte, senza perdita di stabilità. L'enzima modificato è stato poi testato su un campione sintetico di HIV non infettivo, dove ha ottenuto lo stesso miglioramento di 100 volte.
What changes for diagnostics is that the detection target can be swapped. The enzyme is paired with a guide sequence, and the guide is easy to reprogram. The team says the same enzyme could be redirected to SARS-CoV-2, influenza, Ebola, Zika, respiratory syncytial virus or hepatitis C virus. Gao argues that the enzyme itself is the critical part, and his team's version is "optimized for sensitive and stable RNA detection assays" that could potentially be used in commercial tests like RT-qPCR and lateral flow. Those are conditional words, and the study does not test any of these uses. The researchers give no timeline, and the results so far come from lab samples, not from patients or field sites. For a clinic or a water-testing lab, the practical gain would come only once the enzyme is built into a commercial kit and checked against real samples.
Ciò che cambia per la diagnostica è che il bersaglio del rilevamento può essere sostituito. L'enzima è abbinato a una sequenza guida, e la guida è facile da riprogrammare. Il team afferma che lo stesso enzima potrebbe essere indirizzato verso SARS-CoV-2, influenza, Ebola, Zika, virus respiratorio sinciziale o virus dell'epatite C. Gao sostiene che l'enzima stesso sia la parte cruciale, e che la versione del suo team, «ottimizzata per test di rilevamento dell'RNA sensibili e stabili», potrebbe essere impiegata in test commerciali come RT-qPCR e test a flusso laterale. Si tratta di formulazioni condizionali, e lo studio non verifica nessuno di questi usi. I ricercatori non indicano alcun calendario, e i risultati finora provengono da campioni di laboratorio, non da pazienti o da siti sul campo. Per una clinica o un laboratorio di analisi delle acque, il vantaggio pratico arriverebbe solo quando l'enzima sarà inserito in un kit commerciale e verificato su campioni reali.