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Scientists have long used CRISPR, the gene-editing tool, to make precise changes to DNA. Its cousin Cas13a works on something else: RNA, the genetic material carried by viruses such as HIV. At Rice University, a team has now made Cas13a 100 times more sensitive, in lab tests, at spotting that RNA. The work was led by associate professor Yang Gao and graduate student Seye Oladeji, who is the first author of the study published in Cell Chemical Biology.
Los científicos llevan mucho tiempo utilizando CRISPR, la herramienta de edición genética, para realizar cambios precisos en el ADN. Su pariente Cas13a trabaja sobre otra cosa: el ARN, el material genético que transportan virus como el VIH. En la Universidad Rice, un equipo ha conseguido ahora que Cas13a sea 100 veces más sensible, en pruebas de laboratorio, para detectar ese ARN. El trabajo está dirigido por el profesor asociado Yang Gao y por el estudiante de posgrado Seye Oladeji, primer autor del estudio publicado en Cell Chemical Biology.
The problem they set out to solve was a familiar one in diagnostics. A detection test uses an enzyme that binds to a target strand of RNA and then produces a signal, such as a colour change, that a person or a machine can read. Most such assays need harsh conditions to produce that signal. The team's starting version of Cas13a could handle those conditions, but it missed very small amounts of the target. Oladeji's stated ideal is a test that detects as little as one strand of RNA per microliter, around a drop of blood. The starting enzyme was far from that.
El problema que se propusieron resolver es muy conocido en diagnóstico. Una prueba de detección utiliza una enzima que se une a una hebra objetivo de ARN y luego produce una señal, como un cambio de color, que una persona o una máquina puede leer. La mayoría de estos ensayos necesitan condiciones exigentes para generar esa señal. La versión de partida de Cas13a soportaba esas condiciones, pero no detectaba cantidades muy pequeñas del objetivo. El ideal que Oladeji ha planteado es una prueba capaz de detectar hasta una sola hebra de ARN por microlitro, más o menos una gota de sangre. La enzima de partida estaba muy lejos de ese umbral.
The fix began with the protein's shape. Cas13a moves a great deal when it binds its target, which makes its structure hard to capture in fine detail. Oladeji designed a way to hold the enzyme and its RNA target still long enough to resolve it. With the structure in hand, the team picked two candidate regions and tested them in the lab. Altering both made the enzyme too sensitive, so it signalled even without the target. Altering just one raised sensitivity 100-fold, with no loss of stability. The engineered enzyme was then tested against a synthetic, noninfectious HIV sample, where it worked with the same 100-fold improvement.
La solución empezó por la forma de la proteína. Cas13a se mueve mucho cuando se une a su objetivo, lo que dificulta captar su estructura con detalle. Oladeji diseñó un método para sujetar la enzima y su objetivo de ARN el tiempo suficiente como para resolverla. Con la estructura en la mano, el equipo eligió dos regiones candidatas y las probó en el laboratorio. Modificar ambas hizo que la enzima fuera demasiado sensible, de modo que emitía una señal incluso sin el objetivo. Modificar solo una elevó la sensibilidad 100 veces, sin pérdida de estabilidad. La enzima modificada se probó después con una muestra sintética y no infecciosa de VIH, donde logró la misma mejora de 100 veces.
What changes for diagnostics is that the detection target can be swapped. The enzyme is paired with a guide sequence, and the guide is easy to reprogram. The team says the same enzyme could be redirected to SARS-CoV-2, influenza, Ebola, Zika, respiratory syncytial virus or hepatitis C virus. Gao argues that the enzyme itself is the critical part, and his team's version is "optimized for sensitive and stable RNA detection assays" that could potentially be used in commercial tests like RT-qPCR and lateral flow. Those are conditional words, and the study does not test any of these uses. The researchers give no timeline, and the results so far come from lab samples, not from patients or field sites. For a clinic or a water-testing lab, the practical gain would come only once the enzyme is built into a commercial kit and checked against real samples.
Lo que cambia para el diagnóstico es que el objetivo de la detección puede intercambiarse. La enzima va unida a una secuencia guía, y esa guía es fácil de reprogramar. El equipo afirma que la misma enzima podría dirigirse al SARS-CoV-2, la gripe, el ébola, el zika, el virus respiratorio sincitial o el virus de la hepatitis C. Gao sostiene que la enzima en sí es la parte crítica, y que la versión de su equipo está «optimizada para ensayos de detección de ARN sensibles y estables», que podrían usarse en pruebas comerciales como RT-qPCR y de flujo lateral. Son formulaciones condicionales, y el estudio no prueba ninguno de estos usos. Los investigadores no ofrecen ningún calendario, y los resultados obtenidos hasta ahora proceden de muestras de laboratorio, no de pacientes ni de entornos reales. Para una clínica o un laboratorio de análisis de agua, la ventaja práctica solo llegará cuando la enzima se integre en un kit comercial y se contraste con muestras reales.