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Making a drug or a food flavouring often means oxidising alcohols, a step chemists usually perform with harsh oxidants at high temperatures, which leaves toxic waste behind. Living organisms offer a gentler route. Fungi produce galactose oxidases, enzymes that carry out the same reactions on alcohols and simple sugars under mild conditions, using oxygen. Until now, the best-characterised versions came from fungi. A team at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier of NOVA University Lisbon (ITQB NOVA), in Portugal, has now described the first galactose oxidase found in bacteria, which it calls PsGalOx.
Produzir um medicamento ou um aromatizante alimentar implica, muitas vezes, oxidar álcoois, uma etapa que os químicos costumam realizar com oxidantes agressivos a altas temperaturas, deixando para trás resíduos tóxicos. Os organismos vivos oferecem um caminho mais suave. Os fungos produzem galactose oxidases, enzimas que realizam as mesmas reações sobre álcoois e açúcares simples, em condições suaves e com oxigénio. Até agora, as versões mais bem caracterizadas provinham de fungos. Uma equipa do Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier da Universidade NOVA de Lisboa (ITQB NOVA), em Portugal, descreveu agora a primeira galactose oxidase encontrada em bactérias, à qual chama PsGalOx.
The enzyme was hard to work with for years. "For several years, the enzyme proved exceptionally difficult to produce in a soluble form and therefore to characterize," says Lígia Martins, who leads the Microbial & Enzyme Technology laboratory at ITQB NOVA. What changed was AlphaFold, an AI system whose structure predictions helped the team see the enzyme's unusual architecture and identify changes that could improve its production. The bacterial version carries two nearly identical sugar-binding modules next to its catalytic module, a feature the best-known fungal versions do not have. Tomás Frazão, a doctoral student and one of the paper's first authors, says the two copies, which share about 80% sequence identity, have distinct jobs: one enhances sugar binding, the other mainly contributes to protein stability. The team thereby challenges the common assumption that such modules are interchangeable.
A enzima foi difícil de trabalhar durante anos. «Durante vários anos, a enzima revelou-se excecionalmente difícil de produzir numa forma solúvel e, por conseguinte, de caracterizar», afirma Lígia Martins, responsável pelo laboratório de Tecnologia Microbiana e Enzimática do ITQB NOVA. O que mudou foi o AlphaFold, um sistema de inteligência artificial cujas previsões de estruturas ajudaram a equipa a perceber a arquitetura invulgar da enzima e a identificar alterações que poderiam melhorar a sua produção. A versão bacteriana tem dois módulos de ligação a açúcares quase idênticos junto ao seu módulo catalítico, uma característica que as versões fúngicas mais conhecidas não possuem. Tomás Frazão, doutorando e um dos primeiros autores do artigo, explica que as duas cópias, que partilham cerca de 80 % de identidade de sequência, têm funções distintas: uma melhora a ligação aos açúcares, enquanto a outra contribui sobretudo para a estabilidade da proteína. A equipa põe assim em causa a ideia comum de que estes módulos são intercambiáveis.
The researchers then applied directed evolution, which recreates natural selection in the lab: they introduced mutations and screened thousands of bacterial colonies for better variants. The similar modules recombined into single hybrid modules, and these variants produced more soluble protein. The team also found that higher activity did not necessarily mean the enzyme had become a better catalyst; much of the improvement came from cells making more of it, and recognising that was key to further progress. The final variant is 40 to 1,800 times more efficient at processing a range of sugars and alcohols.
Os investigadores aplicaram depois a evolução dirigida, que recria a seleção natural em laboratório: introduziram mutações e rastrearam milhares de colónias bacterianas em busca de variantes melhores. Os módulos semelhantes recombinaram-se em módulos híbridos únicos, e estas variantes produziram mais proteína solúvel. A equipa verificou também que uma atividade mais elevada não significava necessariamente que a enzima se tivesse tornado um catalisador melhor; grande parte da melhoria resultou de as células produzirem mais enzima, e perceber isso foi decisivo para os progressos seguintes. A variante final é 40 a 1 800 vezes mais eficiente no processamento de uma série de açúcares e álcoois.
For chemists and manufacturers, the gain is a potentially cleaner way to make intermediates that feed food, drug and materials production, since the reaction runs under mild conditions with oxygen. Who benefits, and when, is not yet settled. The team plans to keep engineering PsGalOx to act on "substrates of practical interest", aiming at a versatile intermediate for food, pharmaceutical and materials applications, and it wants to map the evolutionary diversity of bacterial oxidases. No industrial partner and no commercial date have been announced.
Para químicos e fabricantes, o ganho representa uma via potencialmente mais limpa para produzir intermediários que alimentam a produção de alimentos, medicamentos e materiais, uma vez que a reação ocorre em condições suaves e com oxigénio. Quem beneficiará, e quando, ainda não está definido. A equipa pretende continuar a modificar a PsGalOx para atuar sobre «substratos de interesse prático», com o objetivo de obter um intermediário versátil para aplicações alimentares, farmacêuticas e de materiais, e quer mapear a diversidade evolutiva das oxidases bacterianas. Não foram anunciados nenhum parceiro industrial nem qualquer data comercial.
The limits are clear. Every result comes from laboratory work, the 40 to 1,800 range spans many different substrates rather than one product, and the enzyme has not yet been reported in an industrial process. The next test is whether the same gains hold on the sugars and alcohols that manufacturers actually need.
Os limites são claros. Todos os resultados provêm de trabalho laboratorial, o intervalo de 40 a 1 800 vezes abrange muitos substratos diferentes e não um único produto, e a enzima ainda não foi relatada num processo industrial. O próximo teste é saber se os mesmos ganhos se mantêm nos açúcares e álcoois de que os fabricantes realmente necessitam.