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Scientists have long used CRISPR, the gene-editing tool, to make precise changes to DNA. Its cousin Cas13a works on something else: RNA, the genetic material carried by viruses such as HIV. At Rice University, a team has now made Cas13a 100 times more sensitive, in lab tests, at spotting that RNA. The work was led by associate professor Yang Gao and graduate student Seye Oladeji, who is the first author of the study published in Cell Chemical Biology.
Os cientistas usam há muito tempo a CRISPR, a ferramenta de edição genética, para fazer alterações precisas no ADN. A sua prima Cas13a atua noutra coisa: o RNA, o material genético transportado por vírus como o VIH. Na Universidade Rice, uma equipa conseguiu agora tornar a Cas13a 100 vezes mais sensível a identificar esse RNA, em testes de laboratório. O trabalho foi liderado pelo professor associado Yang Gao e pelo estudante de doutoramento Seye Oladeji, primeiro autor do estudo publicado na Cell Chemical Biology.
The problem they set out to solve was a familiar one in diagnostics. A detection test uses an enzyme that binds to a target strand of RNA and then produces a signal, such as a colour change, that a person or a machine can read. Most such assays need harsh conditions to produce that signal. The team's starting version of Cas13a could handle those conditions, but it missed very small amounts of the target. Oladeji's stated ideal is a test that detects as little as one strand of RNA per microliter, around a drop of blood. The starting enzyme was far from that.
O problema que a equipa se propôs resolver era um conhecido no diagnóstico. Um teste de deteção usa uma enzima que se liga a uma cadeia-alvo de RNA e produz depois um sinal, como uma mudança de cor, que uma pessoa ou uma máquina podem ler. A maioria destes ensaios precisa de condições exigentes para gerar esse sinal. A versão inicial da Cas13a da equipa aguentava essas condições, mas não detetava quantidades muito pequenas do alvo. Segundo o ideal定 declarado por Oladeji, um teste deve detetar apenas uma cadeia de RNA por microlitro, cerca de uma gota de sangue. A enzima de partida estava muito longe disso.
The fix began with the protein's shape. Cas13a moves a great deal when it binds its target, which makes its structure hard to capture in fine detail. Oladeji designed a way to hold the enzyme and its RNA target still long enough to resolve it. With the structure in hand, the team picked two candidate regions and tested them in the lab. Altering both made the enzyme too sensitive, so it signalled even without the target. Altering just one raised sensitivity 100-fold, with no loss of stability. The engineered enzyme was then tested against a synthetic, noninfectious HIV sample, where it worked with the same 100-fold improvement.
A solução começou pela forma da proteína. A Cas13a mexe-se muito quando se liga ao seu alvo, o que dificulta a captação da sua estrutura em pormenor. Oladeji concebeu uma forma de manter a enzima e o seu alvo de RNA imóveis durante o tempo necessário para os resolver. Com a estrutura em mãos, a equipa escolheu duas regiões candidatas e testou-as em laboratório. Alterar ambas tornou a enzima demasiado sensível, pelo que emitia um sinal mesmo sem o alvo. Alterar apenas uma aumentou a sensibilidade 100 vezes, sem perda de estabilidade. A enzima modificada foi depois testada com uma amostra sintética e não infecciosa de VIH, onde apresentou a mesma melhoria de 100 vezes.
What changes for diagnostics is that the detection target can be swapped. The enzyme is paired with a guide sequence, and the guide is easy to reprogram. The team says the same enzyme could be redirected to SARS-CoV-2, influenza, Ebola, Zika, respiratory syncytial virus or hepatitis C virus. Gao argues that the enzyme itself is the critical part, and his team's version is "optimized for sensitive and stable RNA detection assays" that could potentially be used in commercial tests like RT-qPCR and lateral flow. Those are conditional words, and the study does not test any of these uses. The researchers give no timeline, and the results so far come from lab samples, not from patients or field sites. For a clinic or a water-testing lab, the practical gain would come only once the enzyme is built into a commercial kit and checked against real samples.
O que muda para o diagnóstico é que o alvo de deteção pode ser trocado. A enzima está associada a uma sequência-guia, e essa guia é fácil de reprogramar. A equipa afirma que a mesma enzima poderia ser direcionada para o SARS-CoV-2, a gripe, o Ébola, o Zika, o vírus sincicial respiratório ou o vírus da hepatite C. Gao defende que a enzima em si é a parte crítica, e a versão da sua equipa é «otimizada para ensaios de deteção de RNA sensíveis e estáveis», que poderiam ser usados em testes comerciais como o RT-qPCR e os testes de fluxo lateral. São palavras condicionais, e o estudo não testa nenhuma destas utilizações. Os investigadores não indicam qualquer prazo, e os resultados obtidos até agora vêm de amostras de laboratório, não de doentes nem de locais de terreno. Para uma clínica ou um laboratório de análise de água, o ganho prático só surgiria quando a enzima fosse incorporada num kit comercial e verificada com amostras reais.